Bu çalışmada, yaşları 25-45 arasında 12 sağlıklı bireyin dışkı örnekleri izolasyon materyali olarak kullanılmıştır. 66 bakteri ve 17 maya olmak üzere toplam 83 mikroorganizma izole edilmiştir. İzole edilen bu mikroorganizmaların tanısı MALDI Biotyper (Bruker Daltonic) cihazı ile yapılmıştır. 14 Candida türü ve 3 adet Cryptococcus neoformans, ayrıca 53 laktik asit bakterisine ek olarak Methylobacterium organophilum, Filifactor villosus, Streptomyces hirsutus, Burkholderia gladioli, Paracoccus denitrificans, Shewanella algae, Rhodococcus equi, Cellulomonas gelida, Bacillus vallismortis, Gluconobacter oxydans, Staphylacoccus simulans, Pseudomonas tolaasii olarak tespit edilmiştir. Elde edilen bakteri ve mayaların tamamının gastrik asit (pH 3.5) ve safra tuzuna (0.3%) dayanıklılık, ekzopolisakkarit üretimi (EPS) ve proteoliz, antioksidan aktiviteleri belirlenmiştir. Tüm suşların antimikrobiyellere (antibiyotik, antifungal) duyarlılığı da incelenmiştir. Lactobacillus pentosus (MK7), L. curvatus (MK13), L. plantarum (MK16) ve Enterococcus faecium (MK41, MK49, MK72) suşlarının pH ve safra tuzuna dayanımları yüksek olarak belirlenmiştir. Buna ek olarak, aynı suşlar EPS üretmiş MK16 ise hem EPS üretmiş hem de proteolitik aktivite göstermiştir. Mikroorganizma süpernatantları ve sonikasyon sonucu elde edilen hücre içeriklerinden 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) yöntemi kullanılarak antioksidan aktivite tayini yapılmıştır. İncelenen antioksidan aktiviteleri hücre içeriklerinde daha yüksek olarak gözlenmiş ve MK7, MK13, MK16, MK41, MK49 ve MK72 için sırasıyla %64.4, %71.2, %62.1, %64, %66 ve %65.44 olarak belirlenmiştir. Bakteri suşlarından 40 adedi (%62.5), ampisilin, kloramfenikol, gentamisin, eritromisin, kanamisin, penisilin, streptomisin, tetrasiklin ve vankomisine dirençli olarak saptanmıştır. Maya suşlarının tamamının ketokonazole dirençli ve nistatine duyarlı oldukları görülmüştür. Flukonazol, vorikonazol, amfoterisin B ve itrakonazole duyarlılıkları değişkenlik göstermektedir. Aynı mikroorganizmalar 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ve Trypan Blue (TB) dışlama deneyleri yoluyla kalın bağırsak kanseri hücre hattı (CT26) üzerinde test edilmiştir. MTT ve TB deneyleri ile tümör baskıladığı gözlenen suşlar (MK17, MK45, MK55, MK73) hayvan denemelerinde kullanılmak üzere belirlenmiştir. 30 adet Balb-c faresinden çeşitli gruplar oluşturulmuştur. CT26 kalın bağırsak kanseri hücre hattı ve uygun görülen suşlar bu gruplara uygulanmıştır. Deneme süresi sona erdiğinde bütün grupların doku ve kan örnekleri alınmıştır. Alınan kan örneklerinden plazma ayrılıp, ELISA yöntemi ile interferon gamma (INF-γ), tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α) ve interlökin 10 (IL-10) sitokin değerleri belirlenmiştir. Kalın bağırsak doku örneklerinden immünofloresan yöntemi ile Ki67 boyaması ve süspansiyon haline getirilen dalak hücrelerinden akış sitometri yöntemi ile doğal öldürücü hücre (NK), CD8, CD3 ve Mac-3 boyamaları yapılmıştır. ELISA sonuçları ele alındığında, IFN-γ, TNF-α, IL-10 deneysel verileri, L. plantarum MK55 suşunun, bu sitokinlerin seviyelerinde düzelme sağlayarak sağlıklı kontrol grubunun verilerine yaklaştığını göstermektedir. Akış sitometri verileri değerlendirmesinde ise L. plantarum MK55 suşu, NK1, Mac-3, CD3 ve CD8 ölçümlerinde anlamlı bir şekilde sağlıklı kontrol grubu verilerine yakın olarak bulunmuştur (p<0.05). İmmünofloresan yöntemi ile Ki67 boyaması yapılan kalın bağırsak örneklerinde L. plantarum MK55 suşunun hem tümör enjekte edilmeden önce, hem de tümör enjekte edildikten sonra kanser hücresinin kontrolsüz çoğalmasına engel olabileceği görülmektedir. Seçilen diğer probiyotik suşlar ile yapılan uygulamalarda, tümör hücre çoğalması olmasına rağmen, hasta kontrol grubuna kıyasla tedavi edici etki belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Probiyotikler, Laktik asit bakterileri, Maya, Kanser.
In this study, feces samples of 12 healthy individuals aged 25-45 were used as isolation material. A total of 83 microorganisms, 66 bacteria and 17 yeast, were isolated. 14 Candida species and 3 Cryptococcus neoformans species, as well as 53 lactic acid bacteria were isolated. MALDI Biotyper (Bruker Daltonic) was used to diagnose these isolated microorganisms. In addition, bacteria such as Methylobacterium organophilum, Filifactor villosus, Streptomyces hirsutus, Burkholderia gladioli, Paracoccus denitrificans, Shewanella algae, Rhodococcus equi, Cellulomonas gelida, Bacillus vallismortis, Gluconobacter oxydans, Staphylacoccus simulans, Pseudomonas tolaasii have been identified. Resistance to gastric acid (pH 3,5) and bile salt (0,3%), exopolysaccharide production (EPS) and proteolysis, antioxidant activities of all the bacteria and yeasts obtained were determined. The susceptibility of all strains to antimicrobials (antibiotics, antifungals) has also been studied. The pH and bile resistance of L. pentosus (MK7), L. curvatus (MK13), L. plantarum (MK16) and Enterococcus faecium (MK41, MK49, MK72) strains were determined to be high. In addition, the same strains produced EPS, MK16 produced both EPS and proteolytic activity. Antioxidant activity was determined from the microorganism supernatants and cell contents obtained by sonication using the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The antioxidant activities observed were higher in cell contents and were determined as 64,4%, 71,2%, 62,1%, 64%, 66% and 65,44% for MK7, MK13, MK16, MK41, MK49 and MK72, respectively. 40 of bacteria strains (62.5%) were resistant to ampicillin, chloramphenicol, gentamicin, erythromycin, kanamycin, penicillin, streptomycin, tetracycline and vancomycin. All yeast strains were found to be resistant to ketoconazole and sensitive to nystatin. Sensitivity to fluconazole, voriconazole, amphotericin B and itraconazole varies. The same microorganisms were tested on the colon cancer cell line (CT26) through 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan Blue (TB) exclusion experiments. The strains (MK17, MK45, MK55, MK73) observed to be tumor suppressing with MTT and TB experiments were determined for use in animal experiments. Various groups were formed from 30 Balb-c mice. The CT26 colon cancer cell line and appropriate strains were administered to these groups. At the end of the experiment period, tissue and blood samples of all groups were taken. Plasma was separated from blood samples and interferon gamma (INF-γ), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 10 (IL-10) cytokine values were determined by ELISA method. Natural killer cell (NK), CD8, CD3 and Mac-3 stains were made from the suspended spleen cells by flow cytometry method, followed by Ki67 staining from the large intestine tissue samples by immunofluorescence method. Considering the ELISA results, the experimental data of IFN-γ, TNF-α, IL-10 show that L. plantarum MK55 strain approached the data of the healthy control group by improving the levels of these cytokines. In the evaluation of flow cytometry data, L. plantarum MK55 strain was found to be significantly close to healthy control group data in NK1, Mac-3, CD3 and CD8 measurements (p<0.05). It is observed that L. plantarum MK55 strain may prevent uncontrolled proliferation of cancer cells both before and after the tumor is injected in the colon samples with Ki67 staining by immunofluorescence method. In applications with other selected probiotic strains, although there was tumor cell proliferation, the therapeutic effect was determined compared to the patient control group. Keywords: Probiotics, Lactic acid bacteria, Yeast, Cancer.
Tez (Doktora-PhD) - Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, 2020.
Kaynakça var.
Bu çalışmada, yaşları 25-45 arasında 12 sağlıklı bireyin dışkı örnekleri izolasyon materyali olarak kullanılmıştır. 66 bakteri ve 17 maya olmak üzere toplam 83 mikroorganizma izole edilmiştir. İzole edilen bu mikroorganizmaların tanısı MALDI Biotyper (Bruker Daltonic) cihazı ile yapılmıştır. 14 Candida türü ve 3 adet Cryptococcus neoformans, ayrıca 53 laktik asit bakterisine ek olarak Methylobacterium organophilum, Filifactor villosus, Streptomyces hirsutus, Burkholderia gladioli, Paracoccus denitrificans, Shewanella algae, Rhodococcus equi, Cellulomonas gelida, Bacillus vallismortis, Gluconobacter oxydans, Staphylacoccus simulans, Pseudomonas tolaasii olarak tespit edilmiştir. Elde edilen bakteri ve mayaların tamamının gastrik asit (pH 3.5) ve safra tuzuna (0.3%) dayanıklılık, ekzopolisakkarit üretimi (EPS) ve proteoliz, antioksidan aktiviteleri belirlenmiştir. Tüm suşların antimikrobiyellere (antibiyotik, antifungal) duyarlılığı da incelenmiştir. Lactobacillus pentosus (MK7), L. curvatus (MK13), L. plantarum (MK16) ve Enterococcus faecium (MK41, MK49, MK72) suşlarının pH ve safra tuzuna dayanımları yüksek olarak belirlenmiştir. Buna ek olarak, aynı suşlar EPS üretmiş MK16 ise hem EPS üretmiş hem de proteolitik aktivite göstermiştir. Mikroorganizma süpernatantları ve sonikasyon sonucu elde edilen hücre içeriklerinden 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) yöntemi kullanılarak antioksidan aktivite tayini yapılmıştır. İncelenen antioksidan aktiviteleri hücre içeriklerinde daha yüksek olarak gözlenmiş ve MK7, MK13, MK16, MK41, MK49 ve MK72 için sırasıyla %64.4, %71.2, %62.1, %64, %66 ve %65.44 olarak belirlenmiştir. Bakteri suşlarından 40 adedi (%62.5), ampisilin, kloramfenikol, gentamisin, eritromisin, kanamisin, penisilin, streptomisin, tetrasiklin ve vankomisine dirençli olarak saptanmıştır. Maya suşlarının tamamının ketokonazole dirençli ve nistatine duyarlı oldukları görülmüştür. Flukonazol, vorikonazol, amfoterisin B ve itrakonazole duyarlılıkları değişkenlik göstermektedir. Aynı mikroorganizmalar 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ve Trypan Blue (TB) dışlama deneyleri yoluyla kalın bağırsak kanseri hücre hattı (CT26) üzerinde test edilmiştir. MTT ve TB deneyleri ile tümör baskıladığı gözlenen suşlar (MK17, MK45, MK55, MK73) hayvan denemelerinde kullanılmak üzere belirlenmiştir. 30 adet Balb-c faresinden çeşitli gruplar oluşturulmuştur. CT26 kalın bağırsak kanseri hücre hattı ve uygun görülen suşlar bu gruplara uygulanmıştır. Deneme süresi sona erdiğinde bütün grupların doku ve kan örnekleri alınmıştır. Alınan kan örneklerinden plazma ayrılıp, ELISA yöntemi ile interferon gamma (INF-γ), tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α) ve interlökin 10 (IL-10) sitokin değerleri belirlenmiştir. Kalın bağırsak doku örneklerinden immünofloresan yöntemi ile Ki67 boyaması ve süspansiyon haline getirilen dalak hücrelerinden akış sitometri yöntemi ile doğal öldürücü hücre (NK), CD8, CD3 ve Mac-3 boyamaları yapılmıştır. ELISA sonuçları ele alındığında, IFN-γ, TNF-α, IL-10 deneysel verileri, L. plantarum MK55 suşunun, bu sitokinlerin seviyelerinde düzelme sağlayarak sağlıklı kontrol grubunun verilerine yaklaştığını göstermektedir. Akış sitometri verileri değerlendirmesinde ise L. plantarum MK55 suşu, NK1, Mac-3, CD3 ve CD8 ölçümlerinde anlamlı bir şekilde sağlıklı kontrol grubu verilerine yakın olarak bulunmuştur (p<0.05). İmmünofloresan yöntemi ile Ki67 boyaması yapılan kalın bağırsak örneklerinde L. plantarum MK55 suşunun hem tümör enjekte edilmeden önce, hem de tümör enjekte edildikten sonra kanser hücresinin kontrolsüz çoğalmasına engel olabileceği görülmektedir. Seçilen diğer probiyotik suşlar ile yapılan uygulamalarda, tümör hücre çoğalması olmasına rağmen, hasta kontrol grubuna kıyasla tedavi edici etki belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Probiyotikler, Laktik asit bakterileri, Maya, Kanser.
In this study, feces samples of 12 healthy individuals aged 25-45 were used as isolation material. A total of 83 microorganisms, 66 bacteria and 17 yeast, were isolated. 14 Candida species and 3 Cryptococcus neoformans species, as well as 53 lactic acid bacteria were isolated. MALDI Biotyper (Bruker Daltonic) was used to diagnose these isolated microorganisms. In addition, bacteria such as Methylobacterium organophilum, Filifactor villosus, Streptomyces hirsutus, Burkholderia gladioli, Paracoccus denitrificans, Shewanella algae, Rhodococcus equi, Cellulomonas gelida, Bacillus vallismortis, Gluconobacter oxydans, Staphylacoccus simulans, Pseudomonas tolaasii have been identified. Resistance to gastric acid (pH 3,5) and bile salt (0,3%), exopolysaccharide production (EPS) and proteolysis, antioxidant activities of all the bacteria and yeasts obtained were determined. The susceptibility of all strains to antimicrobials (antibiotics, antifungals) has also been studied. The pH and bile resistance of L. pentosus (MK7), L. curvatus (MK13), L. plantarum (MK16) and Enterococcus faecium (MK41, MK49, MK72) strains were determined to be high. In addition, the same strains produced EPS, MK16 produced both EPS and proteolytic activity. Antioxidant activity was determined from the microorganism supernatants and cell contents obtained by sonication using the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The antioxidant activities observed were higher in cell contents and were determined as 64,4%, 71,2%, 62,1%, 64%, 66% and 65,44% for MK7, MK13, MK16, MK41, MK49 and MK72, respectively. 40 of bacteria strains (62.5%) were resistant to ampicillin, chloramphenicol, gentamicin, erythromycin, kanamycin, penicillin, streptomycin, tetracycline and vancomycin. All yeast strains were found to be resistant to ketoconazole and sensitive to nystatin. Sensitivity to fluconazole, voriconazole, amphotericin B and itraconazole varies. The same microorganisms were tested on the colon cancer cell line (CT26) through 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan Blue (TB) exclusion experiments. The strains (MK17, MK45, MK55, MK73) observed to be tumor suppressing with MTT and TB experiments were determined for use in animal experiments. Various groups were formed from 30 Balb-c mice. The CT26 colon cancer cell line and appropriate strains were administered to these groups. At the end of the experiment period, tissue and blood samples of all groups were taken. Plasma was separated from blood samples and interferon gamma (INF-γ), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 10 (IL-10) cytokine values were determined by ELISA method. Natural killer cell (NK), CD8, CD3 and Mac-3 stains were made from the suspended spleen cells by flow cytometry method, followed by Ki67 staining from the large intestine tissue samples by immunofluorescence method. Considering the ELISA results, the experimental data of IFN-γ, TNF-α, IL-10 show that L. plantarum MK55 strain approached the data of the healthy control group by improving the levels of these cytokines. In the evaluation of flow cytometry data, L. plantarum MK55 strain was found to be significantly close to healthy control group data in NK1, Mac-3, CD3 and CD8 measurements (p<0.05). It is observed that L. plantarum MK55 strain may prevent uncontrolled proliferation of cancer cells both before and after the tumor is injected in the colon samples with Ki67 staining by immunofluorescence method. In applications with other selected probiotic strains, although there was tumor cell proliferation, the therapeutic effect was determined compared to the patient control group. Keywords: Probiotics, Lactic acid bacteria, Yeast, Cancer.