Dünya genelinde 65 yaş üstü nüfusta prevalansı %1 olan Parkinson hastalığı, beyinde substansiya nigra bölgesinde bulunan dopaminerjik nöronların hasarıyla karakterize ve başlıca klinik belirtileri istirahat tremoru, bradikinezi, rijidite ve postüral refleks bozukluğu olan nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın patogenezinde hücresel oksidatif hasara bağlı olarak gelişen mitokondriyal disfonksiyonun ve anormal yapılı alfa-sinüklein agregasyonunun önemli rollerinin olduğu düşünülmektedir. TRP kanalları, çoğunlukla hücre içi kalsiyum sinyalinin düzenlenmesinden sorumlu olan bir katyon kanal ailesidir. TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanalları bu kanal ailesinin birer üyesidir. Parkinson hastalığının in vitro modellemesinde, retinoik asitle farklılaştırılarak dopaminerjik karakter kazandırılan ve aynı zamanda TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanallarının doğal olarak ifadelendiği SH-SY5Y hücre hattı sıklıkla kullanılmaktadır. Hücre kültürü çalışmalarında güncel biyoteknolojik yöntemlerden biri de hedeflenen proteini kodlayan genlerin post-transkripsiyonel olarak susturulması prensibine dayanan siRNA transfeksiyon yöntemidir. In vitro Parkinson hastalığı modeli oluşturma yöntemlerinden biri de mitokondriyal elektron transport zincirini bozarak etki eden MPP+ uygulamasıdır. TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanallarının Parkinson hastalığının patogenezinde rol alıp almadığı veya hastalığın tedavisine yönelik olarak rollerinin olup olmadığı henüz bilinmemektedir. Bu tez çalışmasının amacı; yukarıda belirtilen kanalların Parkinson hastalığının patogenezinde üstlendiği rolün ortaya konması ve hastalığın tedavisine yönelik moleküler mekanizmaların aydınlatılmasıdır. Bu amaca yönelik olarak çalışmamızda SH-SY5Y hücrelerinde MPP+ ile Parkinson hastalığı modeli oluşturulmuş ve aynı zamanda retinoik asit inkübasyonu ile hücrelerin dopaminerjik karakter edinmeleri sağlanmıştır. Ayrıca, siRNA transfeksiyonu ile TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanallarının ifadelenme düzeyleri kontrol altına alınmaya çalışılarak Parkinson hastalığının patogenezindeki rolleri araştırılmıştır. Tez çalışmasının belirlenen hedefleri doğrultusunda; TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanalları aracılı kalsiyum sinyali, hücresel canlılık, apoptoz, kaspaz 3 ve kaspaz 9 enzim aktiviteleri, reaktif oksijen türlerinin üretimi, mitokondriyal membran depolarizasyonu, mono amin oksidaz A ve B enzim aktiviteleri, dopamin ve alfa-sinüklein seviyelerinin belirlenmesine yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak; özellikle TRPM7 ve TRPV1 katyon kanallarının Parkinson hastalığı patolojisinde MPP+ uygulamasının ortaya çıkardığı hasara aracılık ettiği, bu kanalların ifadelenme düzeylerinin azalmasının ise nöronal hücre canlılığı üzerine olumlu etkilerinin olabileceği belirlenmiştir. TRPM7 ve TRPV1 katyon kanallarını hedef alan spesifik antagonistlerin Parkinson hastalığı modellerinde yeni tedavi seçenekleri oluşturmada alternatif olabileceği ve hastalığın tedavisine yeni bir perspektif kazandırabileceği sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler : Parkinson Hastalığı, TRPM7, TRPM8, TRPV1, SH-SY5Y.
Parkinson's disease has a prevalance of 1% population over the age of 65 in worldwide, is a neurodegenerative disease that characterized with the damage of dopaminergic neurons in substantia nigra region of brain and major clinical symptoms are resting tremor, brdykinseia, rigidity and postüral reflex disorder. Mitochondrial dysfunction due to cellular oxidative damage and abnormal alpha-synuclein aggregation are thought to play important roles in the pathogenesis of the disease. TRP channels are a family of cation channels that are mostly responsible for regulating intracellular calcium signaling. TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels are members of this channel family. In the in vitro modeling of Parkinson's disease, the SH-SY5Y cell line is widely used, which is differentiated by retinoic acid to enhance dopaminergic character, and also TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels are naturally expressed in the cell line. One of the current biotechnological methods in cell culture studies is the siRNA transfection method, that is based on the principle of post-transcriptionallay silencing the genes encoding the target protein. One of the methods of inducing an in vitro Parkinson's disease model is MPP+ administration, which acts by disrupting the mitochondrial electron transport chain. How, TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels are involved in the pathogenesis of Parkinson's disease or whether they have roles in the treatment of the disease is not yet known. The main purpose of this thesis is to reveal the role of the channels mentioned above in the pathogenesis of Parkinson's disease and to elucidate the molecular mechanisms for the treatment of the disease. For this aim, in our study, a Parkinson's disease model was induced by MPP+ administration in SH-SY5Y cells and also the cells were provided with dopaminergic character by incubation of retinoic acid. Moreover, by trying to control the expression levels of TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels by siRNA transfection, their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease were investigated. According to the main goals of the thesis study; experiments have been carried out to determine the levels of calcium signalling mediated by TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels, cellular viability, apoptosis, caspase 3 and caspase 9 enzyme activities, production of reactive oxygen species, mitochondrial membrane depolarization, mono amine oxidase A and B enzyme activities, dopamine and alpha-synuclein levels. As a qonsequence, it was determined that especially TRPM7 and TRPV1 cation channels mediated the damage caused by MPP+ administration in the pathology of Parkinson's disease, and decreased expression levels of these channels may have positive effects on neuronal cell viability. It was concluded that specific antagonists targeting the TRPM7 and TRPV1 cation channels could be an alternative in forming new treatment options in Parkinson's disease models and could provide a new perspective to the treatment of the disease. Keywords : Parkinson's Disease, TRPM7, TRPM8, TRPV1, SH-SY5Y.
Tez (Doktora) - Süleyman Demirel Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik Anabilim Dalı, 2021.
Kaynakça var.
Dünya genelinde 65 yaş üstü nüfusta prevalansı %1 olan Parkinson hastalığı, beyinde substansiya nigra bölgesinde bulunan dopaminerjik nöronların hasarıyla karakterize ve başlıca klinik belirtileri istirahat tremoru, bradikinezi, rijidite ve postüral refleks bozukluğu olan nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın patogenezinde hücresel oksidatif hasara bağlı olarak gelişen mitokondriyal disfonksiyonun ve anormal yapılı alfa-sinüklein agregasyonunun önemli rollerinin olduğu düşünülmektedir. TRP kanalları, çoğunlukla hücre içi kalsiyum sinyalinin düzenlenmesinden sorumlu olan bir katyon kanal ailesidir. TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanalları bu kanal ailesinin birer üyesidir. Parkinson hastalığının in vitro modellemesinde, retinoik asitle farklılaştırılarak dopaminerjik karakter kazandırılan ve aynı zamanda TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanallarının doğal olarak ifadelendiği SH-SY5Y hücre hattı sıklıkla kullanılmaktadır. Hücre kültürü çalışmalarında güncel biyoteknolojik yöntemlerden biri de hedeflenen proteini kodlayan genlerin post-transkripsiyonel olarak susturulması prensibine dayanan siRNA transfeksiyon yöntemidir. In vitro Parkinson hastalığı modeli oluşturma yöntemlerinden biri de mitokondriyal elektron transport zincirini bozarak etki eden MPP+ uygulamasıdır. TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanallarının Parkinson hastalığının patogenezinde rol alıp almadığı veya hastalığın tedavisine yönelik olarak rollerinin olup olmadığı henüz bilinmemektedir. Bu tez çalışmasının amacı; yukarıda belirtilen kanalların Parkinson hastalığının patogenezinde üstlendiği rolün ortaya konması ve hastalığın tedavisine yönelik moleküler mekanizmaların aydınlatılmasıdır. Bu amaca yönelik olarak çalışmamızda SH-SY5Y hücrelerinde MPP+ ile Parkinson hastalığı modeli oluşturulmuş ve aynı zamanda retinoik asit inkübasyonu ile hücrelerin dopaminerjik karakter edinmeleri sağlanmıştır. Ayrıca, siRNA transfeksiyonu ile TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanallarının ifadelenme düzeyleri kontrol altına alınmaya çalışılarak Parkinson hastalığının patogenezindeki rolleri araştırılmıştır. Tez çalışmasının belirlenen hedefleri doğrultusunda; TRPM7, TRPM8 ve TRPV1 kanalları aracılı kalsiyum sinyali, hücresel canlılık, apoptoz, kaspaz 3 ve kaspaz 9 enzim aktiviteleri, reaktif oksijen türlerinin üretimi, mitokondriyal membran depolarizasyonu, mono amin oksidaz A ve B enzim aktiviteleri, dopamin ve alfa-sinüklein seviyelerinin belirlenmesine yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak; özellikle TRPM7 ve TRPV1 katyon kanallarının Parkinson hastalığı patolojisinde MPP+ uygulamasının ortaya çıkardığı hasara aracılık ettiği, bu kanalların ifadelenme düzeylerinin azalmasının ise nöronal hücre canlılığı üzerine olumlu etkilerinin olabileceği belirlenmiştir. TRPM7 ve TRPV1 katyon kanallarını hedef alan spesifik antagonistlerin Parkinson hastalığı modellerinde yeni tedavi seçenekleri oluşturmada alternatif olabileceği ve hastalığın tedavisine yeni bir perspektif kazandırabileceği sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler : Parkinson Hastalığı, TRPM7, TRPM8, TRPV1, SH-SY5Y.
Parkinson's disease has a prevalance of 1% population over the age of 65 in worldwide, is a neurodegenerative disease that characterized with the damage of dopaminergic neurons in substantia nigra region of brain and major clinical symptoms are resting tremor, brdykinseia, rigidity and postüral reflex disorder. Mitochondrial dysfunction due to cellular oxidative damage and abnormal alpha-synuclein aggregation are thought to play important roles in the pathogenesis of the disease. TRP channels are a family of cation channels that are mostly responsible for regulating intracellular calcium signaling. TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels are members of this channel family. In the in vitro modeling of Parkinson's disease, the SH-SY5Y cell line is widely used, which is differentiated by retinoic acid to enhance dopaminergic character, and also TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels are naturally expressed in the cell line. One of the current biotechnological methods in cell culture studies is the siRNA transfection method, that is based on the principle of post-transcriptionallay silencing the genes encoding the target protein. One of the methods of inducing an in vitro Parkinson's disease model is MPP+ administration, which acts by disrupting the mitochondrial electron transport chain. How, TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels are involved in the pathogenesis of Parkinson's disease or whether they have roles in the treatment of the disease is not yet known. The main purpose of this thesis is to reveal the role of the channels mentioned above in the pathogenesis of Parkinson's disease and to elucidate the molecular mechanisms for the treatment of the disease. For this aim, in our study, a Parkinson's disease model was induced by MPP+ administration in SH-SY5Y cells and also the cells were provided with dopaminergic character by incubation of retinoic acid. Moreover, by trying to control the expression levels of TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels by siRNA transfection, their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease were investigated. According to the main goals of the thesis study; experiments have been carried out to determine the levels of calcium signalling mediated by TRPM7, TRPM8 and TRPV1 channels, cellular viability, apoptosis, caspase 3 and caspase 9 enzyme activities, production of reactive oxygen species, mitochondrial membrane depolarization, mono amine oxidase A and B enzyme activities, dopamine and alpha-synuclein levels. As a qonsequence, it was determined that especially TRPM7 and TRPV1 cation channels mediated the damage caused by MPP+ administration in the pathology of Parkinson's disease, and decreased expression levels of these channels may have positive effects on neuronal cell viability. It was concluded that specific antagonists targeting the TRPM7 and TRPV1 cation channels could be an alternative in forming new treatment options in Parkinson's disease models and could provide a new perspective to the treatment of the disease. Keywords : Parkinson's Disease, TRPM7, TRPM8, TRPV1, SH-SY5Y.